摘要： zui近上海徐匯區(qū)中心醫(yī)院內(nèi)分泌科發(fā)表了一篇文章關(guān)于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）和酶聯(lián)免疫法(ELISA)對體內(nèi)25（OH）D3水平的測定

目的  同時(shí)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）和酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測患者體內(nèi)25（OH）D3水平，分析兩者結(jié)果的差異。

方法  隨機(jī)選取50例住院患者，對同一血清樣本分別用LC-MS/MS法和ELISA法測定25（OH）D3水平，同時(shí)用LC-MS/MS法測定25（OH）D2的水平。

結(jié)果 LC-MS/MS法測定的維生素D3的均數(shù)為14.99±6.51ng/mL，酶聯(lián)免疫法測定的均數(shù)為20.91±9.70ng/mL，兩者的相關(guān)系數(shù)為0.725（P＜0.01），線性相關(guān)方程為維生素D3（LC-MS/MS法）=4.829+0.486×維生素D3(ELISA法)。LC-MS/MS法組25（OH）D3濃度高于20ng/mL的比例17%，酶聯(lián)免疫法組為52%，LC-MS/MS法組的25（OH）D2和25（OH）D3總濃度高于20ng/mL的為24%。25（OH）D2占25（OH）D總量的8.4%。

結(jié)論  LC-MS/MS法測定的維生素D3的數(shù)值明顯低于ELISA法，兩者正相關(guān)性較高，可經(jīng)方程互換。酶聯(lián)免疫法低估了體內(nèi)維生素D的缺乏，檢測25（OH）D3的同時(shí)需測定25（OH）D2濃度。

關(guān)鍵詞：液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）；酶聯(lián)免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）；25（OH）D3 ；25（OH）D2

維生素D是一個脂溶性維生素，維持人體內(nèi)鈣的平衡，與骨質(zhì)疏松密切有關(guān)，維生素D及活性維生素D在骨質(zhì)疏松的治療中廣泛使用。同時(shí)由于維生素D受體在人體的廣泛分布，維生素D的骨骼外效應(yīng)越來越受到重視，維生素D與受體結(jié)合后能增強(qiáng)免疫功能，減少炎癥反應(yīng)，以及降低細(xì)胞增殖、分化和程序性死亡的癌癥風(fēng)險(xiǎn)等等，補(bǔ)充維生素D可以減少糖尿病、高血壓的發(fā)生，有助于預(yù)防前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤的發(fā)生。因此體內(nèi)維生素D水平的準(zhǔn)確檢測愈發(fā)顯得重要。

 1  材料和方法

 1.1  研究對象

 隨機(jī)選取2011年1月~2012年6月期間在我院住院就診的患者50例，年齡（72.76±11.95）歲，并排除惡性腫瘤、甲亢﹑甲減、甲狀旁腺亢進(jìn)、甲狀旁腺減退、肝硬化、激素服用者。

1.2 方法  

 抽取患者空腹血清，同時(shí)用酶聯(lián)免疫法（ELISA）和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）測定25（OH）D3，并用LC-MS/MS 法測定25（OH）D2。 25-羥基維生素D檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）為靈敏度5nmol/L，精密度批內(nèi)分析 CV5.3%~6.7% ，批間分析 CV4.6%~8.7%。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測技術(shù)（LC-MS/MS）以25羥基維生素D3-氘6和25羥基維生素D2-氘3為內(nèi)標(biāo)，分析數(shù)據(jù)由Analyst1.5軟件采集，然后作定量分析處理。采用API 4000串聯(lián)質(zhì)譜儀（Applied Biosystems Inc.，USA），Analyst 1. 5分析軟件；Shimadzu系列液相色譜儀（日本島津公司）。低、中、高濃度質(zhì)控的準(zhǔn)確度應(yīng)在85%~115%范圍，精密度CV應(yīng)在15%以內(nèi)。

1.3  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間數(shù)據(jù)比較用t檢驗(yàn)，并進(jìn)行pearson相關(guān)分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS13.0完成。

2 結(jié)果

 2.1  液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和酶聯(lián)免疫法的結(jié)果比較

 LC-MS/MS測定的維生素D3的均值為14.99±6.51ng/mL，明顯低于酶聯(lián)免疫法測定的數(shù)值20.91±9.70ng/mL，兩者正相關(guān)性較高，相關(guān)系數(shù)為0.725（P＜0.01），線性相關(guān)方程：維生素D3（LC-MS/MS）=4.829+0.486×維生素D3 (ELISA)。以25（OH）D3濃度20ng/mL為界限，高于20ng/mL的LC-MS/MS組為17%，高于20ng/mL的酶聯(lián)免疫法組為52%，LC-MS/MS組的25（OH）D2和25（OH）D3總濃度高于20ng/mL的為24%。

2.2 LC-MS/MS法對體內(nèi)25（OH）D2、25（OH）D3的檢測

 25（OH）D2的均數(shù)為0.96±3.43ng/mL，25（OH）D2+25（OH）D3總數(shù)的均數(shù)為16.64±7.19ng/mL，25（OH）D2占25（OH）D總量的8.4%。

3  討論  

 維生素D是一類脂溶性的固醇類衍生物，主要有麥角鈣化醇（維生素D2）和膽鈣化醇（維生素D3）兩種，兩者的結(jié)構(gòu)很相似，生理學(xué)功能也基本相同。人體獲得維生素D的途徑有兩種，一是從食物中攝取，其中動物性食物中主要是維生素D3，而植物性食物中則主要是維生素D2；二是由皮膚組織內(nèi)的7-脫氫膽固醇經(jīng)日光中的紫外線照射后發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)化生成維生素D3。除了深海魚、魚肝油、動物肝臟、蛋黃、牛奶和菌類以外，天然食物中維生素D含量較少，人體所需要的維生素D多數(shù)是通過皮膚合成的[1]。來源于膳食或皮膚組織的維生素D本身并不具有生物活性，必須經(jīng)過兩次連續(xù)的羥化過程才能轉(zhuǎn)化成為具有生物活性的有效物質(zhì)。從膳食和皮膚兩條途徑獲取的維生素D與血漿維生素D結(jié)合蛋白（vitamin D binding protein, DBP）結(jié)合后被轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，在肝臟內(nèi)經(jīng)25-羥化酶的作用首先轉(zhuǎn)化成25-羥基維生素D25-hydroxyvitamin D），后者進(jìn)入腎臟后再經(jīng)過1a-羥化酶的催化生成具有生物活性的1,25-二羥基維生素D（25（OH）D2和25（OH）D3 1,25-dihydroxyvitamin D），并在DBP的載運(yùn)下，經(jīng)過血液到達(dá)靶器官并與細(xì)胞上的維生素D受體（vitamin D receptor, VDR）結(jié)合而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。血液中維生素D的半衰期僅為5~7d[2]，只能反映近期從食物中攝取和從皮膚內(nèi)合成的維生素D的量。而25-羥基維生素D的半衰期卻長達(dá)20~30d，是維生素D在血液循環(huán)中的主要存在形式，也是臨床上衡量維生素D營養(yǎng)狀況的主要血液生化指標(biāo)。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn),70 歲以上老人每日應(yīng)攝入維生素D量為600 IU。隨著體內(nèi)維生素D檢測技術(shù)水平的提高和檢測范圍的擴(kuò)大，近幾年對維生素D的缺乏有了新的認(rèn)識，據(jù)估計(jì)可能有超過10億人缺乏維生素D[3]，在婦女健康啟動計(jì)劃（WHI）項(xiàng)目中觀察到美國超過57.1%的絕經(jīng)后婦女維生素D缺乏，其中13%維生素D嚴(yán)重缺乏[4]，之類對這部分人群進(jìn)行的3年隨訪發(fā)現(xiàn)維生素D濃度及飲食攝入量與抑郁癥狀發(fā)生呈負(fù)性關(guān)聯(lián)[5]。在我國，維生素D的缺乏狀態(tài)也同樣嚴(yán)重，無論北方和南方均存在大規(guī)模的維生素D不足，調(diào)查顯示北京成年女性運(yùn)動者平均血清25-羥基維生素D 14.4ng/mL,不運(yùn)動者12ng/mL[6]，在冬季的上海市區(qū)絕經(jīng)后婦女平均血清25-羥基維生素D為17.1ng/mL,存在較嚴(yán)重的維生素不足占30%，維生素缺乏者占調(diào)查人口的68%[7]。

目前電化學(xué)發(fā)光免疫測定法（ECLIA）、稱液相層析（high performance liquid chromatography，HPLC）、酶聯(lián)免疫法（ELISA）、放射免疫分析法（RIA）是測定25-羥基維生素D3的較常用的方法，國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道以RIA和ELISA居多，不同的測定方法得到的數(shù)據(jù)有一定差距，會影響到對人群維生素D3缺乏的判斷。據(jù)2010年Johannes分別用Roche ECLIA法、DiaSoria RIA法和LC-MS/MS法3種方法對120例患者血清的25（OH）D3測定，DiaSoria RIA=0.975 (95%Confidence Interval:0.919–1.031 )×LC-MS/MS+3.02(95%CI:-0.42-6.46) ;Sy/x=8.01;r2=0.90；Roche ECLIA=0.948x（95%CI:0.830-1.067）×LC-MS/MS+13.01 (95%CI: 5.76-20.26); Sy/x=16.90; r2=0.58。LC-MS/MS 與RIA的結(jié)果十分接近，與ECLIA的結(jié)果相差較大[8]。而LC-MS/MS與ELISA對25-羥基維生素D3的測定比較未見報(bào)道，酶免疫分析法主要的缺陷是抗體之間的交叉反應(yīng)導(dǎo)致的方法特異性不足，而色譜分析法可對這些分析物進(jìn)行有效分離，從而獲得足夠的特異性，LC-MS/MS法的高選擇性、特異性和敏感性有很大的優(yōu)勢，同時(shí)LC-MS/MS能對體內(nèi)25（OH）D2的濃度進(jìn)行檢測，25（OH）D2占體內(nèi)維生素D總量的10%左右，其zui終轉(zhuǎn)化成1,25（OH）D3發(fā)揮作用，故25（OH）D2的含量也不應(yīng)忽視。本次研究通過對同一血清標(biāo)本的檢測，LC-MS/MS測定的25（OH）D3濃度明顯低于酶聯(lián)免疫法，國外目前傾向于用LC-MS/MS法更地反映體內(nèi)維生素D的含量。

LC-MS/MS能準(zhǔn)確地測定體內(nèi)25（OH）D的含量，可分別測定25（OH）D3和25（OH）D2 。我國人群中的維生素D缺乏率可能有所低估，補(bǔ)充維生素D有廣闊的前景。

[參考文獻(xiàn)]

[1]  Holick, MF. Sunlight and vitamin D for bone health and prevention of autoimmune diseases. Am J Clin Nutr, 2004, 80(6 Suppl): 1678S-1688S.

[2]  Zeitz U, et al. Impaired insulin secretory capacity in mice lacking a functional vitamin D receptor. FASEB J, 2003, 17(3): 509-511.

[3]  Holick MF. Vitamin D deficiency. N Engl J Med, 2007,357(3): 266-281.

[4]  Millen AE, et al. Predictors of serum 25-hydroxyvitamin D concentrations among postmenopausal women: the Women's Health Initiative Calcium plus Vitamin D clinical ISAl. Am J Clin Nutr, 2010,91(5): ,1324-1335.

[5]  Elizabeth BJ, et al. Vitamin D intake from foods and supplements and depressive symptoms in a diverse population of older women. Am J Clin Nutr, 2011,94:1104-1112.

[6]  Foo LH, et al. Relationship between vitamin D status, body composition and physical exercise of adolescent girls in Beijing. Osteoporos Int, 2009, 20(3): 417-425.

[7]  ZHANG Hao , HUANG Qirenet , et al. Vitamin D status of Shanghai postmenopausal women in winter. CHINESE JOURNAL OF OSTEOPOROSIS. 2011, 2011, 17(1):43-46

[8]  Johannes MW, et al. Measurement of 25-OH-vitamin D in human serum using liquid chromatography tandem-mass spectrometry with comparison to radioimmunoassay andautomated immunoassay. Journal of Chromatography B, 2010,878:1163-1168.